ตรวจ Salmonella and Shigella ในอาหาร

The cultural ‘ Salmonella and Shigella ’ in foods

บทนำทั่วไป 
                  เชื้อรูปท่อนที่อยู่ในลำไส้ที่มีความสำคัญในอาหารมาก ได้แก่ เชื้อสกุลดังต่อไปนี้ Salmonella sp. , Shigella sp. , Vibrio sp. , และEscherichia coli ในบางโอกาส เชื้อเหล่านี้มักเป็นสาเหตุของโรคติดต่อเชื้ออาหาร  ทำให้เกิดโรคในระบบทางเดินอาหาร  เช่น Vibrio cholera ทำให้เกิดอหิวาตกโรค Salmonella ทำให้เกิดโรคไทฟอยด์และโรคท้องร่วง   Shigella ทำให้เกิดโรคบิด และEscherichia coli ทำให้เกิดโรคท้องร่วง เป็นต้น   เชื้อบางชนิดในบางครั้งมีจำนวนน้อยจนอาจตรวจไม่พบถ้าใช้ตัวอย่างอาหารจำนวนน้อย หรือเชื้อเจริญสู้เชื้อชนิดอื่นที่มีในอาหารไม่ได้ แต่ตามพระราชบัญญัติอาหารได้กำหนดไว้ไม่ให้มีเชื้อดังกล่าวในอาหารเพราะเป็นอันตรายต่อผู้บริโภค จึงจำเป็นต้องส่งเสริมการเจริญให้เชื้อดังกล่าวมีจำนวนเพิ่มขึ้นเสียก่อน ซึ่งหากมีเชื้ออยู่ก็จะสามารถตรวจพบได้ง่ายขึ้น
                        อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ส่งเสริมการเจริญและแยกเชื้อแบคทีเรียดังกล่างข้างต้น มีที่นิยมใช้กัน เช่น Selenite enrichment broth(B719/500g), Deoxycholate citrate agar(B163/500g), MacConkey agar(B243/500g), Thioglycollate medium(B044/500g), Bismuth sulfite agar (B115/500g) ,Salmonella-Shigella agar(B310/500g), Brilliant green bile broth(B015/500g), Lauryl sulfate broth(B220/500g), และ Lactose brothb(316/500g). 
ส่วน Vibrio นั้น นิยมใช้ Thioglycollate medium(B044/500g) , Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar (BW766/500g) และ Trypticase soy medium(B040/500g) มากกว่า
                        อาหารที่มักตรวจพบ Salmonella และ Shigella อยู่เสมอ ได้แก่ ไข่ สัตว์ปีกและผลิตภัณฑ์ เนื้อและผลิตภัณฑ์ อาหารทะเลและผลิภัณฑ์

วัสดุอุปกรณ์

1. อาหารเลี้ยงเชื้อ Selenite enrichment broth (B719/500g) ในหลอดหรือขวดที่เตรียมและผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แต่อาหารไม่ต้องฆ่าเชื้อ
2. อาหารเลี้ยงเชื้อ Deoxycholate citrate agar(B163/500g) หรือSalmonella-Shigella  agar(B310/500g) หรือ MacConkey Agar(B243/500g)  ที่เตรียมและผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
3. อาหารเลี้ยงเชื้อ Triple sugar iron agar slant (TSI)(B048/500g) ในหลอดที่ผ่านการฆ่าเชื้อและทำเป็น Slant  แล้ว
4. อาหารเลี้ยงเชื้อ Motility indole lysine (MIL) medium(B590/500g) ในหลอดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
5. Urea broth(B496/500g) 
6.  Polyvalent  Salmonella antisera(/500g) หรือ Shigella grouping antisera(/500g)
7. น้ำกลั่นหรือ peptone water(B035/500g) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว สำหรับเจือจางตัวอย่างอาหาร
8.  จานเพาะเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 
9.  ตัวอย่างอาหาร 
10. ชุดย้อมสีแกรม (Gram’s Iodine BA027/100 ml,Gram’s Safranin    BA028/100 ml,Gram’s Crystal violet  BA087/100 ml) 
11. ปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว

วิธีปฏิบัติ

1. เจือจางตัวอย่างอาหาร 25 กรัมในน้ำกลั่น 225 มิลลิลิตร ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน 
2. นำตัวอย่างอาหารที่เจือจางแล้ว 1 มิลลิลิตร ใส่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Selenite enrichment broth (B719/500g) ที่บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส นานไม่เกิน 16 ชั่วโมง
3. Streak เชื้อที่เลี้ยงใน Selenite enrichment broth (B719/500g) บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Deoxycholate citrate agar (B163/500g) หรือ Salmonella-Shigella  agar(B310/500g) บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส นาน 24-48 ชั่วโมงสังเกตลักษณะโคโลนีของแบคทีเรีย ดังนี้ 
            ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Deoxycholate citrate agar(B163/500g) โคโลนีของ Salmonella, Shigella, และ Proteus จะมีขนาดเล็ก ไม่มีสี ในบางครั้งมีสีดำ ส่วนโคลิฟอร์มจะถูกยับยั้งการเจริญ              ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Salmonella-Shigella  agar(B310/500g) โคโลนีของ Salmonella,
Shigella, และProteus จะมีขนาดเล็ก ไม่มีสี ส่วนโคลิฟอร์มจะถูกยับยั้งการเจริญ
             ในอาหารเลี้ยง MacConkey agar (B243/500g)  โคโลนีของ Salmonella,Shigella  จะมีขนาดเล็ก ไม่มีสี  ส่วนโคลิฟอร์มจะมีสีชมพูเข้ม
4. นำเชื้อในโคโลนีที่มีลักษณะดังกล่าวมาย้อมสีแกรม Salmonella,  Shigellaจะมีรูปร่างเป็นท่อนสั้น ย้อมติดสีแกรมลบ 
5. เพาะเชื้อโคโลนีที่คาดว่าเป็นเชื้อ Salmonella,  Shigella ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Triple sugar iron agar slant (TSI)(B048/500g)  โดยวิธี  Stab และ surface streak บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส  นาน 24 ชั่วโมง สังเกตการเปลี่ยนแปลงลักษณะของอาหารเลี้ยงเชื้อ TSI ดังต่อไปนี้
                ส่วนอาหารเต็มหลอดสีชมพู ส่วนลาดเอียงสีส้ม ( rose base, orange slant) แสดงว่าไม่มีการหมักย่อยน้ำตาลทั้ง 3 ชนิดที่มีอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ ได้แก่ กลูโคส แล็กโทส และซูโครส
                 ส่วนอาหารเต็มหลอดสีเหลือง ส่วนลาดเอียงสีแดง(yellow base, red slant ) แสดงว่ามีการหมักย่อยน้ำตาลกลูโคส แต่ไม่มีการหมักย่อยน้ำตาลแล็กโทสและ/หรือซูโครส
                  ส่วนอาหารเต็มหลอดสีเหลือง ส่วนลาดเอียงสีเหลือง (yellowbase, yellow slant) แสดงว่ามีการหมักย่อยน้ำตาลกลูโคส แล็กโทสและ/หรือซูโครส         อาหารมีรอยแยก (Split or cracked agar ) แสดงว่ามีการผลิตก๊าซ
                   อาหารมีสีดำ (blackening of agar) แสดงว่ามีการผลิตก๊าซ H2S
6. เพาะเชื้อจากโคโลนีที่คาดว่าเป็นเชื้อ  Salmonella ,  Shigella  ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Motility indole lysine (MIL) medium(B590/500g) โดยวิธี Stab บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง สังเกตการเปลี่ยนแปลงลักษณะของอาหารเลี้ยงเชื้อ MIL  medium ดังต่อไปนี้
                        หากมีการสร้าง  lysine decarboxylase อาหารจะเป็นด่างให้สีม่วง  เป็นผลบวก ถ้าให้สีเหลืองเป็นผลลบ 
                        หากแบคทีเรียมีการเจริญนอกรอย stab ไปทั่วทั้งหลอด แสดงว่าแบคทีเรียเคลื่อนที่ได้  ถ้าเชื้อเจริญ เฉพาะที่รอย   stab แสดงว่าเชื้อเคลื่อนที่ไม่ได้       ถ้าหยดน้ำยาโคแว็ค (Kovac) (BA068 Kovac’s Indole reagent 100 ml) ตรวจสอบการเกิดอินโดล (Indole) ถ้าให้สีแดงเป็นผลบวกถ้าเป็นสีเหลืองเป็นผลลบ
7. การทดสอบ Urease นำโคโลนีที่สงสัยไปเพาะเชื้อใน Urea broth บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง สังเกตสีแดงเข้มที่เกิดขึ้นซึ่งจะแสดงว่ามี Urease ซึ่งเป็นคุณสมบัติของ Proteus  เท่านั้นเป็นผลบวก ส่วน Salmonella, Shigella จะให้ผลลบ
8. การจำแนกกลุ่มและประเภทด้วย  antisera นำโคโลนีที่ตรวจสอบแล้วว่าเป็น Salmonella หรือ Shigella มาทำปฏิกิริยากับ Polyvalent salmonella antisera หรือ Shigella grouping antisera โดยวิธี slide agglutination ถ้าเกิดการรวมกลุ่มแสดงว่ามีความจำเพาะกันระหว่าง antiserum กับ เชื้อแบคทีเรีย

บรรณานุกรม

สุมาลี  เหลืองสกุล  2539   จุลชีววิทยาทางอาหาร    ฉบับปรับปรุงใหม่ โรงพิมพ์ชัยเจริญ กรุงเทพฯ Barnett, H.L. 1955. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Burgess, Minneapolis. Collins, C.H.;P.M, Lyne. And J.M Grange. 1995.
            Microbiology. Difco Laboratories incorporated Detroid Michigan . USA.  DiLiello, L.R 1982. Methods in Food and Dairy Microbiology.AVI Publishing Company, Inc
Principle and Specific Application. Oxford: Blackwell Scientific  Publications. Johnson, T.R.; C.L. Case.1989.  Laboratory Experiments in Microbiology. Brief ed., Second ed. The benjamin/ Cummings Publishing Company. Inc. New York.