การตรวจโคลิฟอร์มแบคทีเรีย

โดยวิธี Most probable number of coliform organisms (MPN)
หรือ Multiple tubes fermentation technique

1.บทนำ 
การตรวจสอบคุณภาพน้ำทางแบคทีเรีย เป็นดัชนีที่จะบ่งชี้ถึงความสกปรกของน้ำ เนื่องจากมีแบคทีเรียหลายชนิดที่ก่อให้เกิดโรคเกี่ยวกับทางเดินอาหาร เช่น ไทฟอยด์ บิด และอหิวาห์ ซึ่งสามารถตรวจพบได้ในอุจจาระ เมื่อถูกขับถ่ายปนเปื้อนลงสู่แหล่งน้ำจะถูกแพร่กระจายไปโดยมีน้ำเป็นสื่อ และจะมีผลกระทบโดยตรงต่อสุขภาพของคนที่ใช้น้ำในแหล่งน้ำนั้น ดังนั้นในการตรวจสอบคุณภาพน้ำทางแบคทีเรีย จึงต้องวิเคราะห์หาชนิดและปริมาณของแบคทีเรียที่เป็นอันตราย (Pathogens) ต่างๆ ในน้ำ 
การตรวจสอบชนิดของแบคทีเรียที่เป็นอันตราย (Pathogens) ต่างๆ ในตัวอย่างน้ำโดยตรงอาจต้องใช้เวลานาน ยุ่งยาก และสิ้นเปลืองมาก ซึ่งในปัจจุบันมักนิยมใช้การตรวจหาแบคทีเรียชี้แนะแทน (Bacteriological indicator) โดยเฉพาะแบคทีเรียในกลุ่มโคลิฟอร์ม เพื่อเป็นดัชนีชี้แนะว่าแหล่งน้ำนั้นน่าจะมีการปนเปื้อนของแบคทีเรียที่เป็นอันตรายมากน้อยเพียงใด

2.ขอบเขตและการประยุกต์ใช้
วิธีการนี้สามารถนำไปใช้ในการหาปริมาณเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรียได้ในน้ำดื่ม น้ำผิวดินและน้ำทะเล รวมถึงน้ำเสียจากชุมชนและโรงงานอุตสาหกรรม โดยวิธีนี้ ปริมาณของเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรียในน้ำตัวอย่างจะต้องมีค่าไม่เกิน 1,600 MPN/100ml ซึ่งถ้ามีปริมาณของเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรียสูงมากกว่านี้ จะต้องทำการเจือจางน้ำตัวอย่างก่อนนำไปวิเคราะห์

3.หลักการ
เป็นการวิเคราะห์ปริมาณของเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรีย โดยอาศัยความสามารถในการย่อยสารอาหารให้เกิดก๊าซในหลอดทดลอง จากจำนวนของหลอดที่ให้ผล positive ของแต่ละการเจือจาง 3 ระดับ แล้วนำไปอ่านหาค่าในตารางดัชนี MPN (MPN index) ซึ่งจะบอกจำนวนของโคลิฟอร์มที่มีอยู่ในน้ำ 100 ml. โดยค่าในตารางดัชนี MPN นี้เป็นค่าการวิเคราะห์ทางสถิติ ซึ่งจะเป็นการประมาณทางสถิติถึงปริมาณของโคลิฟอร์มที่น่าจะตรวจพบได้ในน้ำ (Most Probable Number per 100 ml. of sample) ซึ่งวิธีนี้เหมาะสำหรับตัวอย่างน้ำที่ขุ่น หรือน้ำเสียต่างๆ 

4.ข้อควรระวัง
ต้องเขย่าตัวอย่างให้เพียงพอ เพื่อให้เชื้อแบคทีเรียกระจายตัวอย่างสม่ำเสมอ ไม่จับเป็นกลุ่มก้อน 

5. ความหมายของแบคทีเรียกลุ่มโคลิฟอร์ม
แบคทีเรียกลุ่มโคลิฟอร์ม มีคุณสมบัติคือ เป็นพวกที่สามารถเจริญเติบโตได้ในสภาพที่มีอากาศ (aerobic) และพวกที่สามารถเจริญเติบโตได้ในสภาพที่มีอากาศและไม่มีอากาศ (facultative anaerobic) เป็นพวกแกรมลบ (gram negative) ไม่สร้างสปอร์ รูปร่างเป็นท่อนสั้น (rod shape)สามารถย่อยสลายน้ำตาลแลคโตสได้ก๊าซที่อุณหภูมิ 35oC ภายในเวลา 48 ชั่วโมงส่วนพวกฟีคัลโคลิฟอร์ม (Fecal Coliform) จะถูกจำแนกออกจากกลุ่มโคลิฟอร์มแบคทีเรียโดยพวกฟีคัลโคลิฟอร์ม จะสามารถสลายสารอาหาร EC ได้ก๊าซในเวลา 24 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 45oC 

6. การเก็บและการรักษาตัวอย่าง 
การเก็บตัวอย่างน้ำ

• ภาชนะ ขวดเก็บตัวอย่างน้ำเพื่อตรวจสอบทางแบคทีเรีย ต้องล้างให้สะอาดจริงๆ และผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) โดยทำการปิดจุกขวด เอากระดาษ foil หุ้ม แล้วนำไปนึ่งที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที (sterile)

• การทำลายคลอรีน (dechlorination) คลอรีนที่มีอยู่ในตัวอย่างน้ำจะไปทำลายแบคทีเรีย ในระหว่างการนำตัวอย่างมายังห้องปฏิบัติการ ดังนั้นจึงต้องเติม Ns2S2O3 (โซเดียมไธโอซัลเฟต) เพื่อไปทำลายคลอรีนที่มีอยู่ในตัวอย่างน้ำเสียก่อน 
  Na2S2O3 จะถูกเติมลงในขวดสำหรับเก็บตัวอย่างที่สะอาดก่อนนำไป sterile โดยให้มีความเข้มข้นของ Na2S2O3 ประมาณ 100 ml/l โดยปกติมักจะเติม 0.1 ml ของ 10% Na2S2O3 ลงในขวดตัวอย่างขนาด 120 ml

• การลดความเป็นพิษของโลหะหนัก ตัวอย่างน้ำเสียที่มีโลหะหนัก เช่น ทองแดง และสังกะสี สูง จะต้องเติมสาร chelating agent เช่น Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) ลงไปด้วย เพื่อลดความเป็นพิษของโลหะหนักต่อแบคทีเรีย ซึ่งสำคัญมากสำหรับตัวอย่างน้ำที่ต้องเก็บไว้นานกว่า 24 ชั่วโมง 
  EDTA จะถูกเติมลงไปในขวดสำหรับเก็บตัวอย่างที่สะอาดก่อนนำไป sterile โดยให้มีความเข้มข้นของ EDTA ประมาณ 372 mg/l โดยปกติมักจะเติม 0.3 ml ของ 15% EDTA ลงในขวดตัวอย่างขนาด 120 ml ซึ่งอาจรวมกับสารละลาย Na2S2O3 ก่อนเติม 

• วิธีการเก็บตัวอย่างน้ำ จุดเก็บตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ค่าแบคทีเรียโคลิฟอร์มและ ฟีคอลโคลิฟอร์มในน้ำ ให้เก็บตัวอย่างที่ระดับความลึก 30 เซนติเมตร โดยเปิดฝาขวดเก็บตัวอย่าง คว่ำขวดลงไปในน้ำ แล้วค่อยหงายปากขวดขึ้นหันในทิศทางทวนกระแสน้ำ ให้น้ำตัวอย่างไหลเข้าขวดเก็บตัวอย่าง

• ปริมาณของตัวอย่าง ปริมาณของตัวอย่างน้ำที่เก็บเพื่อทำการตรวจสอบทางแบคทีเรีย ไม่ควรน้อยกว่า 100 ml และไม่ควรเก็บตัวอย่างน้ำจนเต็มขวดเก็บตัวอย่าง แต่ให้เหลือที่ว่างไว้ประมาณ 2.5 ซม. เพื่อความสะดวกในการเขย่าตัวอย่างน้ำก่อนทำการวิเคราะห์
  การรักษาตัวอย่างน้ำ
  การวิเคราะห์ทางแบคทีเรีย ควรกระทำทันทีภายหลังการเก็บตัวอย่าง เพื่อหลีกเลี่ยงการเปลี่ยนแปลงที่อาจจะเกิดขึ้น ถ้าไม่สามารถทำการวิเคราะห์ได้ภายในเวลา 1 ชั่วโมง หลังการเก็บควรแช่ตัวอย่างน้ำในน้ำแข็งที่อุณหภูมิ 4oC ในระหว่างการขนส่ง ซึ่งควรใช้เวลาในการขนส่งไม่เกิน 6 ชั่วโมง เพื่อถึงห้องปฏิบัติการให้แช่ในตู้เย็นทันที และควรทำการวิเคราะห์ภายในเวลา 2 ชั่วโมง เมื่อถึงห้องปฏิบัติการให้แช่ในตู้เย็นทันที และควรทำการวิเคราะห์ภายในเวลา 2 ชั่วโมง
  
  7. การเจือจางตัวอย่างน้ำ
  ตัวอย่างน้ำจากแหล่งต่างๆ อาจจะต้องทำการเจือจาง เพื่อให้ความหนาแน่นของโคลิฟอร์มแบคทีเรียอยู่ในระดับที่เหมาะสม คือไม่เกิน 1,600 MPN/100 ml เพื่อให้ได้ช่วงของค่าความเจือจางที่จะไปอ่านเทียบกับตารางดัชนี MPN ได้ ซึ่งจะใช้ชุดอนุกรมของการเจือจางเท่าไรนั้น ขึ้นอยู่กับความสกปรกของน้ำตัวอย่าง เช่น
  น้ำดื่ม อาจใช้ชุดการเจือจาง 10 ml, 1 ml, 0.1 ml
  น้ำจากแม่น้ำ อาจใช้ชุดการเจือจาง 1 ml, 0.1 ml, 0.01 ml
  น้ำจากระบบบำบัด อาจใช้ชุดการเจือจาง 0.1 ml, 0.01 ml, 0.001 ml
  หมายเหตุ
  ถ้าเลือกอนุกรมการเจือจางตามชุดแรก จะอ่านค่าได้โดยตรงจากตารางดัชนี MPN ถ้าเลือกอนุกรมการเจือจางตามชุดสอง ค่าที่อ่านได้จากตารางดัชนี MPN จะต้องคูณด้วย 10ถ้าเลือกอนุกรมการเจือจางตามชุดสาม ค่าที่อ่านได้จากตารางดัชนี MPN จะต้องคูณด้วย 100สำหรับการเจือจางตัวอย่างน้ำสามารถทำได้ดังนี้

• เตรียมหลอดแก้วที่มีน้ำกลั่น หรือ buffered water ปริมาตร 9 ml ที่ผ่านการ sterile แล้วจำนวน 3 หลอด

• เขย่าตัวอย่างน้ำที่เก็บมาอย่างแรง 25 ครั้ง

• ใช้ sterile pipette ดูดน้ำตัวอย่าง 1 ml ใส่ลงในหลอดแก้วที่มีน้ำกลั่นหลอดที่ 1 (อัตราการเจือจาง 1:10)

• เขย่าตัวอย่างน้ำในหลอดแก้วที่ 1 อย่างแรง 25 ครั้ง

• ใช้ sterile pipette ดูดน้ำตัวอย่างจากหลอดแก้วที่ 1 ปริมาตร 1 ml ใส่ลงในหลอดแก้วที่มีน้ำกลั่นหลอดที่ 2 (อัตราการเจือจาง 1:100)

• เขย่าตัวอย่างน้ำในหลอดแก้วที่ 2 อย่างแรง 25 ครั้ง

• ใช้ sterile pipette ดูดน้ำตัวอย่างจากหลอดแก้วที่ 2 ปริมาตร 1 ml ใส่ลงในหลอดแก้วที่มีน้ำกลั่นหลอดที่ 3 (อัตราการเจือจาง 1:1000) 
  จะได้ชุดอนุกรมของการเจือจางตัวอย่างน้ำเป็น 0.1, 0.01, 0.001 นำน้ำตัวอย่างในแต่ละระดับการเจือจางมาวิเคราะห์หาปริมาณโคลิฟอร์มต่อไป

• ระบบการวิเคราะห์ 
  การเลือกระบบหลอดเลี้ยงเชื้อเพื่อวิเคราะห์โคลิฟอร์มตามวิธี MPN โดยทั่วไปนิยมใช้อยู่ 2 ระบบ คือ ระบบ “3” และระบบ “5” หลอดซึ่งเป็นการบอกให้ทราบจำนวนหลอดที่จะใช้หมักต่อหนึ่งระดับการเจือจางของตัวอย่างน้ำ
  ระบบ 3 หลอด ใช้อาหารเหลวน้อย ประหยัดเวลา โอกาสผิดพลาดมาก
  ระบบ 5 หลอด ใช้อาหารเหลวมาก เปลืองเวลา โอกาสผิดพลาดน้อยกว่า
  การวิเคราะห์ปริมาณเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรีย (Total Coliform Bacteria)

เครื่องมือและอุปกรณ์

• หลอดแก้วพร้อมฝาผิด (test tube) ขนาด 15 ml

• หลอดดักอากาศเดอร์แรม (durham tube)

• ปิเปตขนาด 10 และ 1 ml

• ลูกยางใช้กับปิเปตสำหรับดูดน้ำตัวอย่าง

• ตะเกียงแอลกอฮอล

• ตู้เพาะเชื้อ (incubator)

• ลวดที่มีปลายห่วงกลม (wire loop)

• อาหารเลี้ยงเชื้อ

• น้ำกลั่นสำหรับการเจือจางตัวอย่าง

• Lactose broth (LB)

• Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGB)

• ขั้นตอนการวิเคราะห์

• การตรวจสอบขั้นแรก (Presumptive test)

• นำหลอดแก้ว (test tube) ขนาด 15 ml ซึ่งมีหลอดดักอากาศเดอร์แรมวางคว่ำอยู่ภายใน มาบรรจุอาหารเหลวแลคโตส ให้ท่วมหลอดเดอร์แรม ประมาณ 10 ml แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที

• เขย่าตัวอย่างน้ำแรงๆ ขึ้นลง 25 ครั้ง

• ใช้ปิเปต ขนาด 1 ml ดูดตัวอย่างน้ำใส่ลงในหลอดแก้วที่บรรจุอาหารเหลวแลคโตส 3 หรือ 5 หลอดๆ ละ 1 ml ต่อ 1 ระดับของการเจือจาง ซึ่งชุดอนุกรมของการเจือจางในการวิเคราะห์จะใช้การเจือจาง 3 ระดับ/1 ตัวอย่าง

• เขย่าหลอดแก้วเบาๆ เพื่อให้อาหารผสมกับตัวอย่างน้ำ ระวังอย่าให้มีฟองอากาศในหลอดเดอร์แรม

• นำหลอดแก้วทั้งหมดเข้าตู้เพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35± 0.5oC เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง

• นำหลอดแก้วมาตรวจดูก๊าซที่เกิดขึ้นในหลอดเดอร์แรม ถ้าหลอดใดเกิดก๊าซแสดงว่าให้ผลทางบวก (positive) นำหลอดที่เกิดก๊าซไปทดสอบขั้นยืนยันต่อไป

• การตรวจสอบขั้นยืนยัน (Confirmed test)

• นำหลอดแก้ว (test tube) ขนาด 15 ml ซึ่งมีหลอดดักอากาศเดอร์แรมวางคว่ำอยู่ภายใน มาบรรจุอาหารเหลว BGB ให้ท่วมหลอดเดอร์แรม แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที

• นำหลอดที่ให้ผลทางบวกในการตรวจสอบขั้นแรกมาเขย่าเบาๆ และทำการถ่ายเชื้อโดยใช้ลวดที่มีปลายห่วงกลมจุ่มลงไปในหลอดที่ให้ผลทางบวกแล้วนำไปจุ่มลงในหลอดแก้วที่มีอาหาร BGB ทำอย่างนี้ 2-3 ครั้ง

• เขย่าหลอดแก้วเบาๆ เพื่อให้อาหาร BGB ผสมกับเชื้อที่ถ่ายมา ระวังอย่าให้มีฟองอากาศในหลอดเดอร์แรม

• นำหลอดแก้วที่มีอาหาร BGB ทั้งหมด เข้าตู้เพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35± 0.5oC

• นำหลอดแก้วมาตรวจดูก๊าซที่เกิดขึ้นในหลอดเดอร์แรม ถ้าหลอดใดเกิดก๊าซแสดงว่าให้ผลทางบวก (positive) แสดงยืนยันว่ามีเชื้อโคลิฟอร์มในหลอดแก้วที่เกิดก๊าซในการตรวจสอบขั้นแรก

• นำหลอดที่ให้ผลทางบวกไปทดสอบขั้นสมบูรณ์ต่อไป

• การตรวจสอบขั้นสมบูรณ์ (Completed test)

นำเชื้อจากหลอดที่เกิดฟองอากาศในขั้นยืนยันมา streak ลงบนอาหารแข็ง EMB (Eosin Methylene Blue Plate) แล้วนำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24± 2 ชั่วโมง ซึ่งเชื้อแบคทีเรียในกลุ่มโคลิฟอร์มเท่านั้น ที่เจริญเติบโตได้เห็นเป็นโคโลนี ซึ่งโคโลนีจะมีลักษณะมีสีเข้มตรงกลาง และมีสีโลหะตัด (metallic sheen) 
จากนั้นให้ใช้ไม้จิ้มฟันที่ sterile แล้ว จิ้มเอาโคโลนีที่แยกเดี่ยวๆ เห็นชัดในแต่ละ plate ประมาณ 2-3 โคโลนี ใส่ลงในหลอดที่มีอาหาร

• Lactose Broth แล้วนำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24-48 ชั่วโมง ถ้าเป็นเชื้อโคลิฟอร์มจะให้ก๊าซเกิดขึ้นในหลอดดักอากาศเดอร์แรม

• Nutrient Agar Slant แล้นำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24-48 ชั่วโมง จึงนำเชื้อไปทำ gram-stained ซึ่งจะเป็น gram negative แล้วส่องดูลักษณะของแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทัศน์

• การวิเคราะห์ปริมาณเชื้อฟีคอลโคลิฟอร์มแบคทีเรีย (Fecal Coliform)

• เครื่องมือและอุปกรณ์

• หลอดแก้วพร้อมฝาผิด (test tube) ขนาด 15 ml

• หลอดดักอากาศเดอร์แรม (durham tube)

• ปิเปตขนาด 10 และ 1 ml

• ลูกยางใช้กับปิเปตสำหรับดูดน้ำตัวอย่าง

• ตะเกียงแอลกอฮอล

• ตู้เพาะเชื้อ (incubator)

• ลวดที่มีปลายห่วงกลม (wire loop)

• อาหารเลี้ยงเชื้อ

• น้ำกลั่นสำหรับการเจือจางตัวอย่าง

• Lactose broth (LB)

• EC-medium

• ขั้นตอนการวิเคราะห์

• การตรวจสอบขั้นแรก (Presumptive test)

• นำหลอดแก้ว (test tube) ขนาด 15 ml ซึ่งมีหลอดดักอากาศเดอร์แรมวางคว่ำอยู่ภายใน มาบรรจุอาหารเหลวแลคโตส ให้ท่วมหลอดเดอร์แรม ประมาณ 10 ml แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที

• เขย่าตัวอย่างน้ำแรงๆ ขึ้นลง 25 ครั้ง

• ใช้ปิเปต ขนาด 1 ml ดูดตัวอย่างน้ำใส่ลงในหลอดแก้วที่บรรจุอาหารเหลวแลคโตส 3 หรือ 5 หลอดๆ ละ 1 ml ต่อ 1 ระดับของการเจือจาง ซึ่งชุดอนุกรมของการเจือจางในการวิเคราะห์จะใช้การเจือจาง 3 ระดับ/1 ตัวอย่าง

• เขย่าหลอดแก้วเบาๆ เพื่อให้อาหารผสมกับตัวอย่างน้ำ ระวังอย่าให้มีฟองอากาศในหลอดเดอร์แรม

• นำหลอดแก้วทั้งหมดเข้าตู้เพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35± 0.5oC เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง

• นำหลอดแก้วมาตรวจดูก๊าซที่เกิดขึ้นในหลอดเดอร์แรม ถ้าหลอดใดเกิดก๊าซแสดงว่าให้ผลทางบวก (positive) นำหลอดที่เกิดก๊าซไปทดสอบขั้นยืนยันต่อไป

• การตรวจสอบขั้นยืนยัน (Confirmed test)

• นำหลอดแก้ว (test tube) ขนาด 15 ml ซึ่งมีหลอดดักอากาศเดอร์แรมวางคว่ำอยู่ภายใน มาบรรจุอาหารเหลว EC ให้ท่วมหลอดเดอร์แรม แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที

• นำหลอดที่ให้ผลทางบวกในการตรวจสอบขั้นแรกมาเขย่าเบาๆ และทำการถ่ายเชื้อโดยใช้ลวดที่มีปลายห่วงกลมจุ่มลงไปในหลอดที่ให้ผลทางบวกแล้วนำไปจุ่มลงในหลอดแก้วที่มีอาหาร EC ทำอย่างนี้ 2-3 ครั้ง

• เขย่าหลอดแก้วเบาๆ เพื่อให้อาหาร EC ผสมกับเชื้อที่ถ่ายมา ระวังอย่าให้มีฟองอากาศในหลอดเดอร์แรม

• นำหลอดแก้วที่มีอาหาร EC ทั้งหมด เข้าตู้เพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 44.5± 0.2 oC เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง

• นำหลอดแก้วมาตรวจดูก๊าซที่เกิดขึ้นในหลอดเดอร์แรม ถ้าหลอดใดเกิดก๊าซแสดงว่าให้ผลทางบวก (positive) แสดงยืนยันว่ามีเชื้อโคลิฟอร์มในหลอดแก้วที่เกิดก๊าซในการตรวจสอบขั้นแรก

• นำหลอดที่ให้ผลทางบวกไปทดสอบขั้นสมบูรณ์ต่อไป

• การตรวจสอบขั้นสมบูรณ์ (Completed test)

นำเชื้อจากหลอดที่เกิดฟองอากาศในขั้นยืนยันมา streak ลงบนอาหารแข็ง EMB (Eosin Methylene Blue Plate) แล้วนำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24± 2 ชั่วโมง ซึ่งเชื้อแบคทีเรียในกลุ่มโคลิฟอร์มเท่านั้น ที่เจริญเติบโตได้เห็นเป็นโคโลนี ซึ่งโคโลนีจะมีลักษณะมีสีเข้มตรงกลาง และมีสีโลหะตัด (metallic sheen) 
จากนั้นให้ใช้ไม้จิ้มฟันที่ sterile แล้ว จิ้มเอาโคโลนีที่แยกเดี่ยวๆ เห็นชัดในแต่ละ plate ประมาณ 2-3 โคโลนี ใส่ลงในหลอดที่มีอาหาร

• Lactose Broth แล้วนำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24-48 ชั่วโมง ถ้าเป็นเชื้อโคลิฟอร์มจะให้ก๊าซเกิดขึ้นในหลอดดักอากาศเดอร์แรม

• Nutrient Agar Slant แล้นำไปเข้าตู้เพาะเชื้อที่ 35± 0.5oC นาน 24-48 ชั่วโมง จึงนำเชื้อไปทำ gram-stained ซึ่งจะเป็น gram negative แล้วส่องดูลักษณะของแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทัศน์

• การคำนวณ

การคำนวณหาค่าดัชนี MPN 
นำจำนวนของหลอดที่ให้ผล positive ของแต่ละระดับการเจือจางจำนวน 3 ระดับ ในการตรวจสอบขั้นยืนยัน มาหาค่าปริมาณของเชื้อโคลิฟอร์มแบคทีเรียหรือฟิคอลโคลิฟอร์มแบคทีเรีย ในตัวอย่างน้ำเทียบกับตารางดัชนี MPN เช่น ถ้าในอนุกรมการเจือจางตัวอย่างน้ำ 10, 1, 0.1 พบว่า 
10 ml มีหลอดที่ให้ผลบวก 4 หลอดจาก 5 หลอด (ระดับการเจือจางแรกควรเข้าใกล้ 5) 
1 ml มีหลอดที่ให้ผลบวก 3 หลอดจาก 5 หลอด 
0.1 ml มีหลอดที่ให้ผลบวก 1 หลอดจาก 5 หลอด (ระดับการเจือจางสุดท้ายควรเข้าใกล้ 0 ไม่ควรเกิน 2) 
ดังนั้นให้ไปเปิดดูตารางดัชนี MPN จากเลขรวมของหลอดที่ให้ผลบวก คือ 4-3-1 ซึ่งจะให้ค่าดัชนี MPN ของตัวอย่างเป็น 33 MPN/100 ml ของตัวอย่าง 
แต่ถ้าอนุกรมการเจือจางตัวอย่างน้ำที่อ่านผลได้เป็น 1,0.1,0.01 ml ค่าที่อ่านได้จากดัชนี MPN จะต้องคูณด้วย 10 
แต่ถ้าอนุกรมการเจือจางตัวอย่างน้ำที่อ่านผลได้เป็น 0.1, 0.01, 0.001 ml ค่าที่อ่านได้จากดัชนี MPN จะต้องคูณด้วย 100 
บางครั้งผลที่ได้อาจจะอ่านไม่ได้จากตารางดัชนี MPN ให้ทำการคำนวณหาค่า MPN/100 ml

MPN/100 ml =

• รายงานผล

รายงานปริมาณของแบคทีเรียกลุ่มโคลิฟอร์มทั้งหมดและแบคทีเรีย กลุ่มฟีคัลโคลิฟอร์ม หน่วยเป็น MPN/100 m

• การควบคุมคุณภาพ

ใช้น้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121oC นาน 15 นาที แทนการใช้ตัวอย่าง

14. ภาคผนวก (annexes) เอกสารที่เกี่ยวข้อง/เอกสารประกอบ 
ตารางที่ MPN Index and 95% Confidence Limits For Various Combinations of Positive Results When Various Numbers of Tubes Are Used Per Dilution (10 ml, 1.0 ml, 0.1 ml)

***หมายเหตุ  บทความนี้ไม่สามารถใช้อ้างอิงเชิงวิชาการ**** เอกสารอ้างอิง

• American Public health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation. “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.” 18th Edition, American Public Health Association Inc., Washington D.C., 1992.

• กรรณิการ์ สิริสิงห์ และคณะ “เคมีของน้ำ น้ำโสโครกและการวิเคราะห์” คณะสาธารณสุขศาสตร์ ม.มหิดล พ.ศ. 2525.Edit By Mr.muen PH18kku 15/08/2002